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 cours de génie génétique pour les master1 BBM

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مُساهمةموضوع: cours de génie génétique pour les master1 BBM   cours de génie génétique pour les master1 BBM Emptyالثلاثاء يوليو 06, 2010 11:20 am

Rappel des objectifs

* Définir1 les termes suivants : vecteur, clonage, polylinker, plasmide.
* Décrire les étapes de l'insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide.
* Expliquer les étapes (sur un exemple emprunté au cours, aux T.P. ou à votre expérience personnelle) des techniques ayant permis : une mutagénèse, la transposition d'un gène dans une bactérie, la création d'un animal ou d'une plante transgénique.
* Expliquer le principe de la construction d'un vecteur : cet objectif servira à tester la faculté pour l'étudiant(e) de faire une synthèse des connaissances de l'ensemble des chapitres précedents.


1. Définir : préciser dans une phrase concise l'essence d'un objet ou les limites d'un concept en excluant toute notion étrangère et en comprenant toutes les variations possibles de l'objet ou du concept cerné
Partie IV - Le génie génétique
Chapitre 12 - Mutagénèse

12.1 - Création d'un site de restriction

cours de génie génétique pour les master1 BBM 0684fb10f6

BG 91

* Le polymorphisme des fragments de restriction est une des façons les plus simples de mettre en évidence une mutation dans l'ADN. Mais il arrive que la mutation ne modifie aucun des sites de restriction de l'ADN du gène. La mutation Arg3500Gln de l'apolipoprotéine B en est un exemple.
* Pour permettre l'identification d'une telle mutation on va faire l'amplification grâce à des amorces modifiées pour créer un polymorphisme parmi les fragments de digestion de l'ADN amplifié.
* Pour amplifier le fragment de l'apoB on synthétise une amorce (côté 5') complémentaire du brin antisens sauf pour l'extrémité 3'OH qui est ACCC au lieu de ACAC. Le misappariement entre le C de l'amorce et le T du brin antisens n'est pas suffisant pour empêcher l'hybridation et donc la PCR se fait à partir de cette amorce : ACCCGGTCTTCA... Il apparaît donc dans l'ADN amplifié un site CCGG reconnu par l'enzyme Msp I qui digérera l'ADN à cet endroit.
* Si l'amplification se fait à partir de l'ADN muté : ACCCAGTCTTCA... le site Msp I n'apparaît pas, il n'y a donc pas d'hydrolyse à cet endroit et le fragment digéré par Msp I est plus long que dans l'ADN normal.

.
Partie IV - Le génie génétique
Chapitre 12 - Mutagénèse

12.2 - Mutagénèse par PCR
cours de génie génétique pour les master1 BBM 22b717b888
BG 92

* La création d'une mutation artificielle peut être obtenue dans un gène par le jeu des amplifications à partir d'amorces modifiées.
* On prépare l'amplification du gène ou du cDNA grâce à deux amorces placées en amont et en aval de la séquence d'intérêt. On prépare aussi par synthèse des oligonucléotides conformes aux séquences des deux brins du gène autour du codon qui doit être modifié mais dont les bases sont volontairement changées pour qu'elles permettent la synthèse d'un brin complémentaire comprenant la substitution (ou la délétion...) souhaitée.
* On fait une première amplification entre chacune des amorces modifiées et les amorces des extrémités. En réunissant ces deux amplifications et en dénaturant l'ADN, on conduit à une renaturation entre les fragments au niveau des amorces centrales modifiées. Cette hybridation fait apparaître des extrémités 3'OH d'où l'élongation (Taq polymérase) peut se poursuivre jusqu'aux extrémités de la séquence d'intérêt. La poursuite des cycles en présence des amorces amont et aval conduit à l'amplification de cette séquence complète dans laquelle le codon muté a été inséré.

Partie IV - Le génie génétique
Chapitre 13 - Transposition - recombinaison

13.1 - Transposition (définition)
cours de génie génétique pour les master1 BBM F2b4090cd3
BG 93

* Au cours de l'évolution des espèces, le génome s'agrandit continuellement par suite de duplications de gènes et de transpositions.
* Les duplications se produisent en tandem, une séquence se trouvant répétée deux fois dans le génome à la suite de la duplication. Cette duplication permet à chacune des copies de la séquence d'évoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de produire des caractères nouveaux.
* Les transpositions résultent de l'incorporation d'acides nucléiques synthétisés hors du génome :
o soit par incorporation du DNA d'un virus,
o soit par transcription réverse d'un RNA de la cellule ou d'un virus, au moyen d'une transcriptase réverse qui produit un DNA complémentaire (cDNA) et d'une transposase qui l'incorpore au génome de la cellule.

Partie IV - Le génie génétique
Chapitre 13 - Transposition - recombinaison

13.2 - Protéine rec-A
cours de génie génétique pour les master1 BBM F86047cf8d

BG 94

* La protéine recA, expression du gène du même nom, joue un rôle essentiel dans le processus de recombinaison homologue, qui permet la réparation de l'ADN chez Escherichia coli.
* La protéine recA a pour effet de dissocier les deux brins d'un ADN normal pour permettre l'excision d'une séquence destinée à complèter une brèche d'un ADN dont les deux brins sont lésés irréversiblement.
* Ainsi au cours de la réplication si un des deux ADN produits est anormal et ne contient plus d'information, l'autre ADN, dissocié par recA, détachera un de ses brins pour le recombiner avec l'autre ADN : de sorte qu'il y aura de chaque côté un brin porteur de l'information et que les enzymes de réparation pourront complèter les deux doubles hélices avec la même information.
* Le gène recA est réprimé par la protéine LexA, mais dès que le taux d'ADN simple brin augmente dans la cellule, le catabolisme de cette protéine LexA provoque l'expression de recA pour permettre la réparation des fragments d'ADN lésés (système SOS).


13.3 - Transposition (mécanisme)

cours de génie génétique pour les master1 BBM 5f1ed8aee8

BG 94/1

* La transposition est l'insertion d'une séquence entière d'ADN, provenant d'un ADN viral ou d'un ARN cytoplamique rétrotranscrit.
* Les transposons des virus sont des fragments d'ADN double brin terminés par des séquences répétées inverses (la même séquence de 5'3' d'un côté et de 3'5' de l'autre côté). Les rétrotransposons sont obtenus par la transcriptase réverse des rétrovirus à partir d'ARN cytoplamiques : les cDNA obtenus seront transposés dans l'ADN de la cellule hôte.
* Dans les deux cas l'ADN du site de transposition sera ouvert par deux brèches sur les brins de l'ADN décalées de dix à vingt nucléotides, créant ainsi une coupure à brins inégaux. Le transposon va s'insérer entre ces deux extrémités, les vides laissés aux extrémités de l'ADN de l'hôte seront comblés par la DNA polymérase et les brèches restantes liées par la DNA ligase.
* Ainsi, l'ADN au niveau d'un transposon viral présente deux répétitions de même sens en dehors du transposon proprement dit qui est encadré par deux autres répétitions de sens inverse. Au niveau d'un rétrotransposon, on rencontre aussi deux répétitions de même sens en dehors du transposon proprement dit qui est terminé par une partie poly(dA:dT) issue de la rétrotranscription de la queue poly(A) de l'ARN d'origine.

13.4 - Recombinaison simple (mitose)

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BG 94/2

* Lorsque un brin d'ADN est lésé et qu'il est impossible pour la DNA polymérase de synthétiser l'autre brin, il persiste une lacune. L'existence d'un autre chromosome porteur de la même information génétique, est une source d'information pour permettre la reconstitution du gène altéré.
* Une protéine de recombinaison (analogue de recA) va permettre l'excision d'un des brins du gène sain et la recombinaison du fragment excisé avec le gène présentant une lacune. En même temps le brin lésé sera détruit par les nucléases. A ce stade il y aura deux gènes porteurs d'une information complète sur un seul de leurs brins d'ADN.
* Les enzymes de réparation vont alors reconstruire les brins opposés et refermer les brèches, ce qui conduit à une situation normale.
* Ce type de réparation n'est parfait que pour autant que le gène lésé soit le même sur les deux chromosomes (homozygotie). En cas d'hétérozygotie, le fait de reconstituer les deux gènes à partir du même allèle peut conduire à une « perte d'hétérozygotie », quelquefois source de pathologies nouvelles pour des affections récessives donc inapparentes à l'état hétérozygote.

13.5 - Modèle Holliday

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BG 94/3

* L'ouverture d'une brèche dans un brin de DNA et le déroulement de la double hélice permet à des fragments de DNA simple brin de s'hybrider de façon anormale.
* L'existence de séquences homologues sur l'autre chromosome de la même paire peut conduire ce brin libre à s'hybrider avec la séquence complémentaire du chromosome homologue (1).
* Dans ce cas les brèches au bout des deux brins échangés peuvent être refermées par la DNA ligase (2).
* Une telle structure avec entrecroisement de brins de deux DNA homologues est appelée structure Holliday (du nom de son découvreur en 1964). Cette structure est mobile et l'échange peut se propager par glissement de la structure le long des deux hélices en allant dans le même sens (3).
* On peut représenter la structure Holliday en séparant les hélices en forme de croix. Cela permet de voir qu'il y a deux façons de séparer les deux hélices : soit en coupant horizontalement (flèche rouge) et on obtient alors un échange de fragment d'ADN entre les deux chromosomes (4), soit en coupant verticalement (flèche jaune) et on aboutit alors à un échange complet des ADN des deux chromosomes au delà du point de croisement (5).


13.6 - Crossing-over
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BG 94/4

* Les échanges entre chromosomes homologues peuvent conduire à des échanges de fragments ou à des échanges de brins entiers de DNA.
* Au cours de la méiose en particulier, de tels échanges se produisent fréquemment entre les chromosomes d'origine paternelle ou maternelle de telle sorte que les gènes des chromosomes des cellules filles (gamètes) sont une recombinaison hétérogène de fragments des deux origines.
* Le résultat implique un mélange de caractères héréditaires des deux parents qui constituent le patrimoine du nouvel individu, bien que l'homologie des échanges garantisse le maintien de chaque gène sur chaque locus avec un allèle (homozygote) ou deux (hétérozygote)

14.1 - Carte du virus SV40





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مُساهمةموضوع: رد: cours de génie génétique pour les master1 BBM   cours de génie génétique pour les master1 BBM Emptyالخميس يوليو 08, 2010 12:08 pm

مشكوووووووووووووووور الموضوع المتميز
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مُساهمةموضوع: رد: cours de génie génétique pour les master1 BBM   cours de génie génétique pour les master1 BBM Emptyالأربعاء يوليو 14, 2010 5:00 pm

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